1534年，罗马教皇克雷芒七世委托米开朗基罗为西斯廷礼拜堂祭坛后的墙壁创作《最后的审判》，但创作尚未开始，克雷芒七世就不幸过世。1535年9月1日，当继任的保禄三世诏令米开朗基罗为圣彼埃尔的建筑绘画雕塑总监时，他已经在准备绘制《最后的审判》稿本了。1536年1月，壁画部分正式动工，泥匠们开始往教堂墙壁上涂抹泥灰。由于壁画面积巨大，为了保护壁画不沾到灰尘，米开朗基罗还顺手发明了一种突出的里衬，这是类似装置中最早的。

　　《最后的审判》是传统的基督教绘画题材之一，在很多教堂中都能找到这一主题的绘画，但米开朗基罗描绘在西斯汀礼拜堂墙壁的这幅，无疑是最伟大的。这个故事来源于《新约全书·启示录》，讲述世界末日到来之时，死去的基督复活并飞升天堂，在那里审判人生在世之善恶，良善之人得以进入天堂，为恶者则只能入地狱受苦以赎生前之罪。米开朗基罗的这幅作品虽然尺幅巨大仍是构图严谨而结构分明。画面的上部描绘的是天堂：以基督为中心，圣母玛丽亚倚靠在基督身侧，12门徒及一些殉道者环绕身周。下半部分中，死去的人们接受审判，得以进入天堂的灵魂从画面左侧飞升，罪恶的灵魂则从画面右侧堕入右下角的地狱中。左右两侧人物强烈的动态为整幅画面带来了呈螺旋形的运动感。

　　从1536年到1541年11月，米开朗基罗一直专注于这件事。与《创世纪》一样，这幅作品也是他独自完成的，仅有一位学徒作为助手，负责为他磨碎颜料以及将轮廓线从纸稿摹转到墙壁上等辅助工作。当然应该也会有专门的泥匠每天将一乔纳塔（一天工作量单位）的泥灰平整地涂抹在墙壁上。他全心全意地进行创作，那个时候米开朗基罗已年过花甲，虽然这并未影响到他的创造力，但疾病与年迈让他身手不再敏捷。1939年的一天，这位老人不幸从脚手架上跌落，腿部受伤，但性格多疑的他拒绝接受检查和治疗。这幅作品被认为表现了米开朗基罗的宗教观念：他将自己放入了画中，成为圣巴多罗谬殉道时被剥下的皮囊。

　　在画作将要完成时，保禄三世亲自来视察，并征询陪同人员的意见。司礼长塞斯纳——据瓦萨里的记载，此人迂腐至极——宣称，在一个如此庄严的地方大肆表现裸体是非常不雅的，这对教皇礼拜堂来说是大不敬：在教皇做弥撒时，人们却不得不面对着如此尺寸巨大的400多具赤裸的身体。这让米开朗基罗愤怒不已：世界末日就要来了，他却还在那里担心要不要穿衣服的事情。虽然米开朗基罗并没有当面表示什么，但在教皇一行离开后，却将塞斯纳的脸移植到了地狱中判官米诺斯身上，让他只能永远地留在地狱中。后来塞斯纳向保禄三世抱怨此事时，教皇对他开玩笑说：“若是米开朗基罗将你放入监狱，我尚有办法救你出来，但他如果把你打入地狱，那我也爱莫能助了，地狱里的人是救不了的。”

　　虽然米开朗基罗在世时这幅饱受争议的作品被勉强接受，但在其死后不久，教会还是以“任何色情的东西都应当被禁绝”为由，委托画家伏尔泰拉给裸身的灵魂们都“穿上裤子”，这位画家后来也被人们谑称为“裤子画家”。